Chiama +39 081 3656790|info@mmbiotech.it

COVID-19 ImmunoRank™ Neutralization MICRO-ELISA Kit (CE IVD) – test sierologico ultima generazione – Leinco

990,00

ImmunoRank™ Neutralization MICRO-ELISA Kit (IVD) è un test sierologico IgG di ultima generazione per testare l’efficacia del vaccino.

IVA come da Legge di Bilancio 2021, art. 1, comma 452

Descrizione

Il test consente il dosaggio semi-quantitativo degli anticorpi neutralizzanti che bloccano l’interazione tra il dominio di legame del recettore (RBD) della glicoproteina Spike del virus con il recettore cellulare di superficie ACE2 impedendo così l’ingresso del virus SARS-Cov-2 nelle cellule ospiti.

Quando effettuare un NAB test

  • a partire dalla 2ª settimana dopo la somministrazione dell’ultima dose di vaccino;
  • nei soggetti che hanno contratto l’infezione e sono successivamente risultati negativi al tampone. In questo caso è utile attendere 7-10 giorni.

Dati

Confronto tra ImmunoRank e titoli PRNT50 (plaque reduction neutralization test, test usato per quantificare il titolo di anticorpo neutralizzante per un virus). Sono stati raccolti retrospettivamente 117 campioni totali costituiti da una coorte specifica dello studio di 75 campioni negativi di plasma da donatori apparentemente sani raccolti prima del 12/01/2019, 32 campioni positivi raccolti da soggetti risultati positivi per SARS-CoV-2 mediante PCR approvata dall’UEA test e 10 campioni contenenti anticorpi potenzialmente cross-reattivi contro l’HIV.

Dati ImmunoRank

Uso del dosaggio sierologico COVID-19 ImmunoRank Neutralization MICRO-ELISA per differenziare il potenziale neutralizzante di un pannello di anticorpi monoclonali umani ricombinanti sequenziati da sopravvissuti a COVID-19. I cloni A, B, C e D riconoscono il dominio di legame del recettore r-SARS-CoV-2 (RBD) mentre il clone E è specifico per il dominio r-N-terminale SARS-CoV-2 (NTD) della proteina spike. Gli anticorpi sono stati aggiunti nel plasma umano negativo raccolto prima del 12.01.2019

Rilevare gli anticorpi neutralizzanti con Immunorank

COVID-19 ImmunoRankTM MICRO-ELISA, è un test di neutralizzazione del virus surrogato (sVNT) semiquantitativo progettato per la rilevazione di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 circolanti presenti nel siero o nel plasma. Il test è un saggio di immunoassorbimento enzimatico in fase solida (ELISA) che utilizza un substrato enzimatico cromogenico come indicatore. La proteina ricombinante del recettore responsabile dell’ingresso del virus SARS CoV-2, l’enzima 2 di conversione dell’angiotensina umana (ACE2), è immobilizzata nei pozzetti in polistirene della micropiastra del test (fase solida). In una micropiastra di miscelazione e incubazione separata, viene aggiunta a ciascun pozzetto la proteina ricombinante solubile del dominio di legame del recettore SARS-CoV-2 (RBD) coniugata alla perossidasi di rafano (HRP).

In seguito vengono aggiunti anche i controlli e i campioni da testare diluiti ai pozzetti della piastra di incubazione. Durante il periodo di agitazione e incubazione della piastra, gli anticorpi con specificità di legame alla regione RBD della proteina spike SARS-CoV-2, se presenti nei campioni e nei controlli, si legheranno al coniugato RBD-perossidasi di rafano. Dopo il periodo di incubazione, i controlli e i campioni di analisi vengono trasferiti dai pozzetti della piastra di incubazione ai pozzetti della piastra di analisi contenente il recettore ACE2 umano ricombinante immobilizzato e lasciati incubare. Dopo il periodo di incubazione, i pozzetti vengono lavati per rimuovere la matrice del campione non legata e un substrato enzimatico cromogeno (perossido di idrogeno, H2O2 e tetrametilbenzidina, TMB) viene aggiunto a ciascun pozzetto e incubato, determinando lo sviluppo di un colore blu. L’intensità del colore blu è indirettamente proporzionale alla concentrazione degli anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 nei campioni testati.

Dopo 15 minuti dall’aggiunta del cromogeno, viene pipettata una soluzione di arresto della reazione e l’intensità del colore viene letta in un lettore di piastre di assorbanza alla lunghezza d’onda di 450 nm. Vengono forniti controlli di qualità positivi e negativi per garantire l’integrità del test. Viene fornito inoltre un algoritmo per calcolare l’indice di neutralizzazione del campione espresso come percentuale di neutralizzazione (SNI%) per ciascun campione testato. Per i dettagli leggere la scheda tecnica allegata.

Materiale fornito incluso nel kit

Fare riferimento ai data sheet specifici del prodotto per un elenco completo dei contenuti del kit.

S2500-1: 1 round bottom Incubation 96 well polystyrene plate. (1 x 96 Wells)
S2500-2: 1 Microplate 96-well polystyrene strips (12 x 8 Strips)
S2500-3: 1 Positive Control (1X) (300 μl)
S2500-4: 1 Negative Control (1X) (300 μl)
S2500-5: 1 Calibrator Control (1X) (300 μl)
S2500-6: 1 Sample Diluent (1X) (15 ml)
S2500-7: 1 RBD-Enzyme Conjugate (100X) (80 μl)
S2500-8: 1 Conjugate Diluent (1X) (10 ml)
S2500-9: 1 Wash Buffer (20X) (25 ml)
S2500-10: 1 Substrate-Chromogen (12 ml)
S2500-11: 1 Stop Solution(10 ml)
S2500-12: 2 Adhesive Plate Sealers (2 x 1 each)

Condizioni di conservazione

Chiuso: il kit deve essere conservato a 2 – 8 ° C dal momento del ricevimento. Per la data di scadenza del kit fare riferimento all’etichetta sulla confezione. Tutti i componenti sono stabili fino a questa data di scadenza.

Aperto: una volta aperto, i reagenti del kit sono stabili se conservati a 2 – 8 ° C. Fare riferimento all’etichetta sulla confezione del kit per la data di scadenza.

Indicazione di instabilità o deterioramento: il deterioramento dei reagenti del kit può essere indicato quando un valore del controllo di qualità è al di fuori dell’intervallo specificato. I risultati dei test associati non sono validi e i campioni devono essere nuovamente testati con un nuovo kit in cui i valori di controllo rientrano negli intervalli specificati.

Standard ricombinati

Anticorpi neutralizzanti monoclonali umani ricombinanti contro SARS-CoV-2 RBD

Procedura di analisi

La procedura del test deve essere seguita come scritto. Qualsiasi deviazione da questa procedura può produrre risultati errati. Fare riferimento ai data sheet specifici del prodotto per una procedura step-by-step completa.

  1. Lasciare riposare tutti i reagenti del kit per 30 minuti per raggiungere la temperatura ambiente di 18-30 ° C e miscelare delicatamente ciascuna fiala agitando su vortex a bassa velocità o capovolgendo 10 volte.
  2. Il controllo positivo, il controllo negativo e il controllo calibratore devono essere analizzati in duplicato sulla micropiastra a 96 pozzetti ogni volta che si esegue il test. È possibile analizzare fino a novanta (90) campioni di prova in singolo su ciascuna piastra piena.
  3. Aggiungere 60 μl di diluted RBD-Enzyme Conjugate in ogni pozzetto della piastra di incubazione corrispondente a un controllo o test da eseguire.
  4. Pipettare 60 μl di controllo positivo, controllo negativo e controllo calibratore diluiti in due fasi nei singoli pozzetti della piastra di incubazione in duplicato.
  5. Pipettare 60 μl di campioni di test diluiti nei singoli micropozzetti corrispondenti della piastra di incubazione in singolo, come mostrato nella Figura 1 del foglietto illustrativo.
  6. Coprire la piastra di incubazione con un sigillante per piastre adesivo e incubare su uno shaker per micropiastre impostato a 300 rpm per 30 +/- 1 minuto a temperatura ambiente di 18-30 ° C.
  7. Posizionare un numero sufficiente di microplate strip wells contenenti ACE2 ricombinante immobilizzato in un supporto per stip per eseguire tutti i controlli del test in duplicato e i campioni del test in singolo, come mostrato nella Figura 2 del foglietto illustrativo.
  8. Dopo un periodo di incubazione di 30 minuti, aggiungere 100 μl di controllo positivo, controllo negativo e controllo calibratore dalla piastra di incubazione in duplicato alla piastra del test.
  9. Dopo un periodo di incubazione di 30 minuti, aggiungere 100 μl di campione da testare dalla piastra di incubazione in singolo alla piastra di test.
  10. Coprire ciascuna piastra del test con un sigillante per piastre adesivo e incubare senza agitare per 30 minuti +/- 1 minuto a +37 ° C ± 1 ° C in un incubatore senza anidride carbonica. Per il processamento manuale dei pozzetti della micropiastra, coprire la piastra del test con un adesivo protettivo per piastre e iniziare l’incubazione. Quando si utilizzano processori automatici per micropiastre, per l’incubazione, seguire le raccomandazioni del produttore dello strumento. ATTENZIONE: non impilare le piastre l’una sull’altra. Dovrebbero essere distribuiti come un unico strato per una distribuzione uniforme della temperatura.
  11. Lavaggio delle piastre: rimuovere la striscia adesiva protettiva, aspirare ogni pozzetto e lavare, ripetendo il processo per un totale di quattro lavaggi. Lavare riempiendo ogni pozzetto con 300 μl di tampone di lavaggio 1X utilizzando un flacone a spruzzo manuale, un distributore di collettori o un autowasher lasciando il tampone di lavaggio 1X in ogni pozzetto per 30-60 secondi. La rimozione completa del liquido in ogni fase è essenziale per una buona prestazione. Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere ogni residuo di tampone di lavaggio aspirando o decantando. Capovolgi il piatto e tampona con carta assorbente pulita.
  12. Aggiungere 100 μl di cromogeno substrato a ciascun pozzetto. Incubare per 15 +/- 1 minuti a temperatura ambiente (18-30 ° C) al riparo dalla luce diretta.
  13. Immediatamente al termine dell’incubazione di 15 +/- 1 minuto, aggiungere 50 μl di soluzione bloccante in ogni pozzetto. Il colore nei pozzetti dovrebbe cambiare da blu a giallo. Se il colore nei pozzetti è verde o il cambiamento di colore non appare uniforme, picchiettare delicatamente la piastra per garantire un’accurata miscelazione.
  14. Immediatamente dopo aver aggiunto la soluzione di arresto, leggere l’assorbanza dall’intensità del colore di ciascun pozzetto a 450 nm. Prima della misurazione, agitare accuratamente la micropiastra per garantire una distribuzione omogenea della soluzione nei pozzetti.

ATTENZIONE: La piastra deve essere letta a 15 minuti +/- 1 minuto. Se non vengono letti entro questo periodo di tempo, i risultati potrebbero non essere accurati. Il test deve essere ripetuto.

Background scientifico

Le autorità cinesi hanno identificato un’epidemia causata da un nuovo o nuovo coronavirus chiamato SARS-CoV-2. Il virus può causare malattie respiratorie da lievi a gravi; noto come Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) precedentemente denominato 2019-nCoV.1 SARS-CoV-2 è diverso da altri sei coronavirus umani precedentemente identificati, compresi quelli che hanno causato precedenti focolai di sindrome respiratoria acuta grave (SARS) e la Medio Oriente Sindrome respiratoria (MERS).

La proteina SARS-CoV-2 Spike (S) è costituita dai domini S1 e S2.2 Il dominio S1 contiene il dominio di legame del recettore (RBD) che può legarsi specificamente ai recettori dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) sulle cellule bersaglio. 2 La proteina nucleocapside (N) SARS-CoV-2 svolge un ruolo nella trascrizione, replicazione e confezionamento del genoma dell’RNA virale, influenzando anche le risposte delle cellule ospiti come il ciclo cellulare e la traduzione.3 SARS-CoV-2 è strettamente correlato al virus SARS, identificato per la prima volta nel 2002-2003. Un’analisi approfondita ha identificato il SARS-CoV-2 RBD come essenziale per il legame ACE2. Sia SARS-CoV che SARS-CoV-2 utilizzano il recettore cellulare ACE2 per entrare nelle cellule, con SARS-CoV-2 come legame con maggiore affinità.Il vaccino e lo sviluppo terapeutico stanno prendendo di mira porzioni della proteina spike, inclusa la porzione RBD.

References & Citations

1. van Dorp L, Acman M, Richard D, et al. Emergence of genomic diversity and recurrent mutations in SARS-coV-2. Infec Genet Evol2020;83:104351. Doi:10.1016/j.meegid.2020.104351
2. Hoffmann et al., 2020, Cell 181, 271–280
3. Kang, S. et al. (2020) Acta Pharm Sin B. Apr 20. doi: 10.1016/j.apsb.2020.04.009
4. Wrappet al.Science: 2020.
5. Tai et al. Characterization of the receptor-binding domain (RBD) of 2019 novel coronavirus: implication for development of RBD protein as a viral attachment inhibitor and vaccine. Cellular & Molecular Immunology 17, 613 – 620. 2020.