Colture Cellulari

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Colture Cellulari2018-11-29T10:07:33+00:00
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Erogazione di linee cellulari

Le linee cellulari che costituiscono la collezione di modelli cellulari disponibili possono essere erogate in varie forme: criopreservata, in attiva crescita o come pellet cellulare. Le linee cellulari in forma criopreservata vengono consegnate mediante prelievo fisico delle ampolle congelate delle singole linee cellulari presenti in azoto liquido. L’erogazione delle linee cellulari in attiva crescita include la revitalizzazione della linea cellulare, la conta cellulare e la stima della vitalità cellulare e il mantenimento in coltura della linea stessa. Tutte le linee cellulari erogate sono preventivamente controllate dal punto di vista: 1) microbiologico mediante saggi di rilevamento del micoplasma; 2) morfologico, con continui monitoraggi in microscopia; 3) in termini di capacità proliferativa, tramite accurata ed ottimale manipolazione colturale.

Amplificazione, stima della vitalità e della conta cellulare e criopreservazione di linee cellulari

Linee cellulari continue umane ed animali vengono opportunamente amplificate e ne viene definita la conta e la vitalità cellulare. I campioni vengono quindi centrifugati, risospesi in appropriate soluzioni di congelamento, portati a -80°C all’interno di specifici supporti che consentono la discesa graduale della temperatura (circa 1°C/minuto) ed infine trasferiti in azoto liquido, dove vengono conservati.

Ottenimento di cellule mononucleate da sangue periferico e/o da sangue midollare, stima della vitalità e della conta cellulare.

Il campione di sangue viene stratificato lentamente su uno strato di polisaccaride Ficoll-Paque. Dopo una specifica centrifugazione, la maggior parte delle componenti cellulari del sangue vengono separate e la componente costituita da cellule mononucleate contenuta all’interno di ciascun campione di sangue viene chiaramente distinta e prelevata (“anello” di mononucleate) e ne viene determinata la vitalità e la conta. A richiesta le cellule così purificate sono criopreservate.

Stabilizzazione di linee cellulari continue umane linfoblastoidi con Epstein-Barr Virus (EBV).

Cellule mononucleate da campioni di sangue periferico vengono isolate di mediante gradiente Ficoll-Paque e messe in coltura a contatto con il Virus di Epstein-Barr. I linfociti B, unici ospiti naturali del virus di Epstein-Barr, infettati originano segni morfologici caratteristici. Le colture sono quindi amplificate fino alla creazione di una linea linfoblastoide stabile, che viene poi criopreservata.

Saggi di rilevamento del micoplasma

La contaminazione da micoplasma in linee cellulari viene evidenziata mediante due tipologie di saggio, il saggio bioluminescente e il saggio mediante test colturale su agar. Il Saggio Bioluminescente MycoAlert® rileva rapidamente la contaminazione da micoplasma (>50 colonie) mediante valutazione del consumo di ATP da parte delle linee cellulari. Una linea cellulare contaminata da micoplasma consumerà maggior ATP rispetto al controllo negativo presente in ogni seduta di rilevamento. Il Saggio mediante test colturale su agar rileva la contaminazione di differenti specie di micoplasma in linee cellulari mediante allestimento di un doppio braccio colturale: uno in anaerobiosi e l’altro in aerobiosi. Il braccio in anaerobiosi si basa sull’uso di colture su agar solido del sovranatante di linee cellulari potenzialmente contaminate e dura 14 giorni. Parallelamente viene allestita la coltura in brodo che rappresenta il braccio in aerobiosi e dura anch’essa 14 giorni. Al termine dei 14 giorni, il brodo arricchito di potenziale micoplasma viene trasferito su agar solido per altri 14 giorni. Dopo 28 giorni di coltura, questa procedura di rilevamento del micoplasma è in grado di svelare la presenza anche di una sola colonia di micoplasma.

Eradicazione del micoplasma

Vengono allestite 5 sub-colture di ogni linea cellulare da decontaminare e ciascuna viene trattata con uno dei seguenti 5 antibiotici: Enrofloxacina (per 7 giorni), Ciprofloxacina (per 14 giorni), Mycoplasma Removal Agent (MRA) (per 7 giorni) e BM-Cicline 1 e 2 (per 21 giorni). Al termine dei singoli trattamenti, ciascuna subcultura viene mantenuta per 30 giorni in assenza di antibiotici ed infine vengono eseguiti i test di rilevamento del micoplasma (sia test bioluminescente che saggio colturale su agar).

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